La Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC) separa las moléculas según su tamaño, o más precisamente, su volumen hidrodinámico. Se basa en la discriminación de los componentes individuales de la muestra por los poros del material de empaque. Las moléculas de muestras grandes no pueden o sólo pueden penetrar parcialmente en los poros y eluir de la columna primero, mientras que las moléculas más pequeñas pueden acceder a todos o a un mayor número de poros y eluir después. La SEC es el único modo de cromatografía que no implica la interacción con una fase estacionaria por medio de la adsorción o la partición de los solutos.
Los términos SEC, GFC (cromatografía de filtración en gel) y GPC (cromatografía de permeación en gel) se refieren a la misma técnica cromatográfica. En el GFC se utiliza una fase móvil acuosa, mientras que en el GPC se emplea una fase móvil orgánica. El término general SEC abarca ambos usos.
La separación en la cromatografía de intercambio iónico (IEC o IEX) se basa en la adsorción reversible de moléculas de solutos cargados a grupos funcionales inmovilizados de carga opuesta. Las biomoléculas generalmente tienen grupos cargados en sus superficies, que cambian con el pH del tampón. La elución puede lograrse cambiando la fuerza iónica o el pH, de los cuales el cambio de la fuerza iónica mediante el aumento de la concentración de sal es el más común.
El IEX se subdivide además en cromatografía de intercambio catiónico y de aniones. Las fases de intercambio de aniones y cationes se clasifican como fuertes o débiles, dependiendo de cuánto varíe el estado de ionización de los grupos funcionales con el pH. Una fase de intercambio iónico fuerte tiene la misma densidad de carga en su superficie a lo largo de una amplia gama de pH, mientras que la densidad de carga de una fase de intercambio iónico débil cambia con el pH, lo que afecta a su selectividad, que difiere en los diferentes valores de pH.
La cromatografía líquida de fase inversa (RPC) se ha convertido en una herramienta aceptada para la separación de péptidos, proteínas y otros biopolímeros en las industrias farmacéutica, química y bioquímica.
La cromatografía líquida de fase inversa (RPC) separa moléculas basadas en interacciones no polares y requiere una fase móvil polar, normalmente una mezcla de agua o solución tampón con eluyentes polares como el metanol, el acetonitrilo o el tetrahidofurano, y una fase estacionaria no polar como hidrocarburos de cadena larga unidos a un soporte de sílice o híbrido.
La cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) se basa en las interacciones no polares que son inducidas por fases móviles de alta salinidad. Las fases estacionarias son similares a la Cromatografía de Fase Reversa (RPC), pero la densidad de los grupos funcionales es menor. Se utiliza una fase estacionaria débilmente no polar con una fase móvil acuosa que contiene una alta concentración de una sal caótropa.
La técnica se aplica principalmente a la separación de proteínas, que se eluyen disminuyendo la concentración de sal o añadiendo un bajo porcentaje de disolvente orgánico. Aunque también se basa en interacciones hidrofóbicas, la selectividad en las separaciones de HIC es claramente diferente de la de la cromatografía de fase reversa. A pesar de la menor capacidad de pico en la HIC en comparación con la RPC, la HIC permite mantener la estructura nativa de la proteína, que resulta útil en los análisis posteriores.
La cromatografía de afinidad (AFC) ofrece el mayor potencial de especificidad y selectividad para el aislamiento o la purificación de biomoléculas. Casi todas las moléculas biológicas pueden purificarse sobre la base de una interacción específica entre su estructura química o biológica y un ligando de afinidad adecuado.
En la AFC, la molécula objetivo es específica y reversiblemente adsorbida por un ligando complementario e inmovilizada en una matriz. Entre los ejemplos de un ligando complementario figuran un inhibidor, un análogo o cofactor de sustrato o un anticuerpo que reconoce específicamente la molécula objetivo. La selectividad se basa a menudo en el reconocimiento espacial, un mecanismo de "llave en mano".
La molécula adsorbida se eluye posteriormente ya sea por un desplazamiento competitivo o un cambio de conformación a través de un cambio en el pH o en la fuerza iónica. Los pares moleculares típicos son antígenos y anticuerpos, enzimas y coenzimas, y azúcares con lectinas.
Se puede obtener una purificación de varios miles de veces debido a la alta selectividad de las interacciones de afinidad. Aunque la cromatografía de afinidad no es específica, en el sentido de que ninguna enzima interactúa con un solo sustrato, es el método más selectivo para separar las proteínas.
La cromatografía de proteína A se basa en la unión específica y reversible de anticuerpos a un ligando de proteína A inmovilizado. La proteína A es una proteína de superficie de 56 kDa de Staphylococcus aureus. Está compuesta por cinco dominios de unión de inmunoglobulinas, cada uno de los cuales es capaz de unirse a las proteínas de muchas especies de mamíferos, sobre todo a la inmunoglobulina G (IgG) a través de la cadena pesada dentro de la región Fc. Mientras que la forma nativa de la proteína A se utilizó como ligante de la primera generación de resinas de proteína A, las formas recombinantes (rProteína A) producidas en E. coli son las más prevalentes hoy en día. Las modificaciones de la estructura proteínica del ligando, la aparición de ligandos compuestos por multimotores de dominio único y la unión multipunto han dado lugar a las resinas de proteína A cáusticas estables, de gran capacidad y extremadamente robustas que se utilizan hoy en día.
Las columnas TSKgel FcR-IIIA se basan en un receptor Fc gamma IIIA recombinante que se inmoviliza como ligando en partículas de polímero. Separan los anticuerpos monoclonales según su afinidad al receptor y permiten un análisis rápido de la actividad biológica, así como el fraccionamiento junto con la actividad biológica.