La cromatografía líquida de fase inversa (RPC) se ha convertido en una herramienta aceptada para la separación de péptidos, proteínas y otros biopolímeros en las industrias farmacéutica, química y bioquímica.
La cromatografía líquida de fase inversa (RPC) separa moléculas basadas en interacciones no polares y requiere una fase móvil polar, normalmente una mezcla de agua o solución tampón con eluyentes polares como el metanol, el acetonitrilo o el tetrahidofurano, y una fase estacionaria no polar como hidrocarburos de cadena larga unidos a un soporte de sílice o híbrido.
La Cromatografía Líquida de Fase Normal y de Interacción Hidrofílica (HILIC) se utiliza principalmente para separar los compuestos polares de los hidrófilos. En el modo de fase reversa, los compuestos muy polares a menudo no son retenidos suficientemente en un bajo porcentaje de orgánicos, o incluso en la fase móvil 100% acuosa. El orden de elución en la fase normal es opuesto al que se encuentra en la fase reversa para la misma mezcla de compuestos. Aunque tradicionalmente se utilizaban fases móviles orgánicas no polares y una fase estacionaria de sílice en la fase normal LC, hoy en día la mayoría de las separaciones se realizan con fases móviles orgánicas acuosas y una fase estacionaria más polarizada. Este modo de HPLC se conoce normalmente como HILIC, cromatografía líquida de interacción hidrofílica.
Mediante el uso de una columna de fase amida o aminoblada, los compuestos polares pueden ser retenidos por un mecanismo de retención de cromatografía de interacción hidrófila o de fase normal. Las fases móviles típicas en el HILIC son tampones acuosos con modificadores orgánicos, principalmente acetonitrilo. En contraste con el comportamiento de retención en fase reversa, en HILIC, los solutos se retendrán más tiempo al aumentar el porcentaje de acetonitrilo.
La separación en la cromatografía de intercambio iónico (IEC o IEX) se basa en la adsorción reversible de moléculas de solutos cargados a grupos funcionales inmovilizados de carga opuesta. Las biomoléculas generalmente tienen grupos cargados en sus superficies, que cambian con el pH del tampón. La elución puede lograrse cambiando la fuerza iónica o el pH, de los cuales el cambio de la fuerza iónica mediante el aumento de la concentración de sal es el más común.
El IEX se subdivide además en cromatografía de intercambio catiónico y de aniones. Las fases de intercambio de aniones y cationes se clasifican como fuertes o débiles, dependiendo de cuánto varíe el estado de ionización de los grupos funcionales con el pH. Una fase de intercambio iónico fuerte tiene la misma densidad de carga en su superficie a lo largo de una amplia gama de pH, mientras que la densidad de carga de una fase de intercambio iónico débil cambia con el pH, lo que afecta a su selectividad, que difiere en los diferentes valores de pH.
